Dowody na ograniczoną zmienność receptorów antygenów na niedoczynność komórek T w autoimmunologicznej chorobie tarczycy czesc 4

Filtry przepłukano 2 x SSC 0,05% pirofosforanem sodu w wzrastających temperaturach (50 ° C, 60 ° C i 70 ° C). Po każdym przemyciu bloty eksponowano na błonę rentgenowską z ekranem intensyfikującym w -80 ° C przez 3 do 24 godzin. Ilościowa ocena genów V. receptora komórek T
Aby uzyskać dane ilościowe dotyczące proporcji wyrażanych genów V. receptora komórek T, zbadaliśmy autoradiografy za pomocą skomputeryzowanej densytometrii ilościowej (Model 300A, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA), stosując procedurę matematyczną do wyprowadzania objętości obszaru z autoradiografii skanowanie (wersja 2.0, Quantum obrazu, dynamika molekularna). Każdy gen V. receptora komórek T następnie eksprymowano jako procent wszystkich genów V. wykrytych w tym skanie.
Kontrola jakości
Wysoki poziom czułości techniki PCR może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich i różnic w rozmiarach fragmentów, gdy analizowane są niedojrzałe lub nieprawidłowe mRNA. Opisana powyżej technika hybrydyzacji umożliwiła jedynie wysoce specyficzną ocenę ekspresji genów, ponieważ przeprowadzono ją w bardzo ostrych warunkach, a zmierzone fragmenty miały określoną i przewidywaną wielkość. Ponadto, wszystkie użyte preparaty cDNA najpierw testowano za pomocą PCR z inną parą starterów specyficznych dla regionu C. w celu zapewnienia obecności cDNA receptora komórek T o przewidywanym rozmiarze transkrypcji 312 pz (5 CAGAAGCCTGACCCTGCCGTGTAC i 3 CAGGTTTTGAAAGTTTAGGTTCGTATCTGT ). Ponieważ wszystkie PCR były przeprowadzane w tych samych warunkach, było również możliwe, że nie każdy oligomer wzmacniający był annealing do cDNA w jego optymalnych warunkach. Dlatego włączono jednoczesne badania receptorów komórek T z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej jako kontroli w celu wykazania adekwatności warunków eksperymentalnych. Badania obejmujące PCR bez cDNA lub z cDNA, które nie były istotne dla tego badania, nie wykazały żadnych transkryptów.
Analiza statystyczna
W razie potrzeby wyniki porównano za pomocą sparowanych lub niesparowanych testów t-Studenta.
Wyniki
Analiza markerów powierzchni komórek T
Poprzednio opublikowaliśmy szczegółową ocenę fenotypów zarówno limfocytów T krwi obwodowej, jak i niedoczynności tarczycy u pacjentów z autoimmunologiczną chorobą tarczycy.3 Wyniki w niewielkiej liczbie próbek w tym badaniu były podobne. Od 40 do 80 procent limfocytów niedokrwiennych pochodziło z komórek T w momencie rozpoczęcia hodowli. Analizy podgrup według fenotypu wykazały wyższy stosunek komórek supresorowo-cytotoksycznych (CD8 +) do komórek pomocniczych (CD4 +) w limfocytach intratroidalnych niż w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (Tabela 1). Ponadto, jak wykazano w innym miejscu, 3 udział limfocytów T indukującego supresorowo (CD45RA +) był wyższy w tkance tarczycy niż w krwi obwodowej u tych pacjentów (Tabela 1).
Ekspresja V.-Gene przez komórki T krwi obwodowej od podmiotów normalnych i pacjentów z autoimmunologiczną chorobą tarczycy
Figura 2. Figura 2. Ilościowa dystrybucja ekspresji genu V. receptora komórek T w komórkach T z tkanki tarczycy u pacjenta z autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy
[hasła pokrewne: olejek melisowy, lekarska spółdzielnia pracy, rosucard ]