Dowody na ograniczoną zmienność receptorów antygenów na niedoczynność komórek T w autoimmunologicznej chorobie tarczycy ad

Pacjenci zostali wybrani bez innych kryteriów selekcji i na podstawie dostępności próbek i świadomej zgody. Badaliśmy również tkankę tarczycy od płodu w 22 tygodniu ciąży, uzyskaną za zgodą naszej komisji odwoławczej oraz za świadomą zgodą. Pacjenci zostali zgrupowani na podstawie dostępności jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, inwazyjnych kultur komórek T lub chirurgicznie uzyskanej tkanki tarczycy (Tabela 1); Jedynie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej uzyskano od zdrowych osobników. Choroba Gravesa-Basedowa była określona przez obecność klinicznej i biochemicznej nadczynności tarczycy i wykrywalnych przeciwciał przeciwko receptorowi TSH lub normalny lub zwiększony 24-godzinny wychwyt tarczycy z jodu radioaktywnego i normalnej lub powiększonej tarczycy, jak określono za pomocą skanowania radiojodem. Przeciwciała przeciwko receptorowi TSH zmierzono za pomocą testu radioreceptorowego (BRS Research, Cardiff, Wielka Brytania). Wszyscy pacjenci z chorobą Gravesa-Basedowa byli leczeni lekiem przeciwtarcznym (metimazolem lub propylotiouracylem) w czasie pobierania próbek; ci, od których uzyskano próbki chirurgiczne, również leczono jodkiem nieorganicznym przez dwa tygodnie przed operacją. Autoimmunologiczne zapalenie tarczycy zostało określone przez obecność klinicznej i biochemicznej niedoczynności tarczycy oraz wysokie miana przeciwciał przeciw tyreoglobulinie, peroksydazie tarczycy lub obu tych przeciwciał, mierzone za pomocą swoistych enzymatycznych testów immunoabsorpcyjnych12 i, jeśli to możliwe, potwierdzonych histologicznie.
Przygotowanie limfocytów T.
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej przygotowano z heparynizowanej krwi przez odwirowanie z gradientem gęstości Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) i przechowywano w ciekłym azocie, jak opisano w innym miejscu.3, 8 Limfocytów niedoboru tarczycy otrzymano przez trawienie kolagenazą tkanki tarczycy uzyskany w czasie operacji, po którym następuje wirowanie w gradiencie gęstości i przechowywanie w ciekłym azocie.3, 8 Pomiędzy 2 x 106 i 5 x 106 komórek uzyskano z każdej próbki. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie limfocyty rozmrożono (o 80 do 90% żywotności, o czym świadczy zabarwienie błękitem trypanowym) i ekspandowano w pożywce RPMI 1640 buforowanej HEPES zawierającej penicylinę i streptomycynę (GIBCO, Madison, Wis.) Z 10 procentami płodów. cielęca surowica, 10% interleukina-2 (Biotest, Frankfurt, Niemcy) i .g fitohemaglutyniny (PHA, Sigma, St. Louis) na mililitr na pięć do sześciu dni. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej i limfocyty niedoczynności tarczycy od pięciu pacjentów hodowano jednocześnie w identycznych warunkach.
Znaczniki powierzchni komórek T
Przeprowadzono fenotypowanie w dwóch barwach fluorescencji za pomocą par mysich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko różnym zdefiniowanym determinantom ludzkich komórek T i analizowano za pomocą standaryzowanego laserowo aktywowanego cytometru przepływowego (Epics C, Coulter Electronics, Hialeah, Fla.). Zastosowane przeciwciała monoklonalne pozwoliły na oznaczenie obecności limfocytów pomocniczych (CD4 +), supresorowo-cytotoksycznych (CD8 +) i supresorowo-indukujących (CD45RA +), a także całkowitej liczby limfocytów T (CD2 +) i limfocytów B (CD29 + ) .3
T-Cell-Receptor PCR
Całą ilość komórkowego RNA ekstrahowano z hodowli komórek T i tkanki tarczycy za pomocą tiocyjanianu guanidyniowego i fenolu (RNAzol B, Cinna / Bioteck Laboratories International, Friends-wood, Tex.) I przechowywano w alkoholu i soli fizjologicznej
[podobne: levopront ulotka, acerola sanbios, warunki oddawania krwi ]